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濕熱滅菌

濕熱滅菌法比干熱滅菌法更有效。濕熱滅菌是利用熱蒸汽滅菌。在相同溫度下,濕熱的效力比干熱滅菌好的原因是:①熱蒸汽對細(xì)胞成分的破壞作用更強。水分子的存在有助于破壞維持蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的氫鍵和其他相互作用弱鍵,更易使蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)含水量與其凝固溫度成反比(表2-1);②熱蒸汽比熱空氣穿透力強,能更加有效地殺滅微生物:③蒸汽存在潛熱.當(dāng)氣體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w時可放出大量熱量,故可迅速提高滅菌物體的溫度。 
多數(shù)細(xì)菌和真菌的營養(yǎng)細(xì)胞在60℃左右處理15min后即可殺死,酵母菌和真菌的胞子要耐熱些,要用80℃以上的溫度處理才能殺死,而細(xì)菌的芽胞更耐熱,一般要在120℃下處理15min才能殺死。濕熱滅菌常用的方法有常壓蒸汽滅菌和高壓蒸汽滅菌。
(一)常壓蒸汽滅菌 
    (1)常壓蒸汽滅菌是濕熱滅菌的方法之一,在不能密閉的容器里產(chǎn)生蒸汽進行滅菌。在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下,常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌方法。此外,不宜用高壓蒸煮的物質(zhì)如糖液、牛奶、明膠等,可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法所用的滅菌器有阿諾氏(Aruokd)滅菌器或特制的蒸鍋,也可用普通的蒸籠。由于常壓蒸汽的溫度不超過100℃,壓力為常壓,大多數(shù)微生物的營養(yǎng)細(xì)胞能被殺死,但芽胞細(xì)菌卻不能在短時間內(nèi)死亡,因此必須采取間歇滅菌或持續(xù)滅菌的方法,以殺死芽胞細(xì)菌,達到完全滅菌。     1)巴氏消毒法  是用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等不能進行高溫滅菌的液體的一種消毒方法,其主要目的是殺死其中的無芽胞病原菌(如牛奶中的結(jié)核分枝桿菌或沙門氏菌),而又不影響其特有風(fēng)味。巴氏消毒法是一種低溫消毒法,具體的處理溫度和時間各有不同,一般在60-85℃下處理15-30min。具體的方 法可分兩類,**類是較老式的,稱為低溫維持法,例如在63℃下保持30min可進行牛奶消毒;另一類是較新式的,稱為高溫快速法,用于牛奶消毒時只要在85℃下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能殺滅引起Q熱的病原體--伯氏考克斯氏體(一種立克次氏體)。 
    2)間歇滅菌法  又稱分段滅菌法。適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。方法是:將待滅菌的培養(yǎng)基在100℃下蒸煮30-60min,以殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細(xì)胞,然后置室溫或20-30℃下保溫過夜,誘導(dǎo)殘留的芽胞萌發(fā),第二天再以同法蒸煮和保溫過夜,如此連續(xù)重復(fù)3天,即可在較低溫度下達到徹底滅菌的效果。例如,培養(yǎng)硫細(xì)菌的含硫培養(yǎng)基就應(yīng)用間歇滅菌法滅菌,因為其中的元素硫經(jīng)常規(guī)的高壓滅菌(12l℃)后會發(fā)生熔化,而在100℃的溫度下則呈結(jié)晶狀。 3)蒸汽持續(xù)滅菌法  微生物制品的土法生產(chǎn)或食用菌菌種制備時常用這種方法。在容量較大的蒸鍋中進行。從蒸汽大量產(chǎn)生開始,繼續(xù)加大火力保持充足蒸汽,待鍋內(nèi)溫度達到100℃時,持續(xù)加熱3-6h,殺死jue大部分芽胞和全部營養(yǎng)體,達到滅菌目的。 
    以上三種方法通常是在無高壓蒸汽滅菌條件的地方(如農(nóng)村)使用。     (2)滅菌過程中應(yīng)注意 
    1)使用間歇法或持續(xù)法滅菌時必須在滅菌物里外都達到100℃后開始計算滅菌時間,此時鍋頂上應(yīng)有大量蒸汽冒出。 
    2)為利于蒸汽穿透滅菌物,鍋內(nèi)或蒸籠上堆放物品不宜過滿過擠,應(yīng)留有空隙。固體曲料大量滅菌時,每袋以1.5-2.0kg為宜,料袋在鍋內(nèi)用蓖子分層隔開,不能堆壓在一起。 
    3)火大水足才能保證蒸汽足,蒸鍋里應(yīng)先把水加足。一次持續(xù)滅菌時,如鍋內(nèi)盛水量不能維持到底.應(yīng)在蒸鍋側(cè)面安裝加水口,以便在蒸煮過程中添水。添水應(yīng)用開水,以防驟然降溫。 
    4)間歇法滅菌時應(yīng)在每次加熱后,迅速降溫,然后在室溫放置24h,再第二次加熱。如果降溫慢,往往使未殺死的雜菌大量滋長,反面導(dǎo)致滅菌物變質(zhì),特別是固體曲料包裝過大時,靠近中心部分更易發(fā)生這種情況。 
    5)從使用效果看,分裝試管、三角瓶或其他容器的培養(yǎng)基,因其體積小,透熱快以用間歇法為佳。固體曲料,因其包裝較大,透熱慢,用間歇法容易滋生雜菌變質(zhì)或者水分蒸發(fā)過多,曲料變得不新鮮,影響培養(yǎng)效果,因此使用一次持續(xù)滅菌法較好。   (二)高壓蒸汽滅菌 
    高壓蒸汽滅菌法是微生物學(xué)研究和教學(xué)中應(yīng)用**廣、效果**好的濕熱滅菌方法。     (1)滅菌原理 
    高壓蒸汽滅菌是在密閉的高壓蒸汽滅菌器(鍋)中進行的。其原理是:將待滅菌的物體放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)。把鍋內(nèi)的水加熱煮沸,并把其中原有的冷空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密閉。再繼續(xù)加熱就會使鍋內(nèi)的蒸汽壓逐漸上升,從而溫度也隨之上升到100℃以上。為達到良好的滅菌效果,一般要求溫度應(yīng)達到121℃(壓力為0.1MPa),時間維持15-30min。也可采用在較低的溫度(115℃,即0.075MPa)下維持35min的方法。此法適合于一切微生物學(xué)實驗室、醫(yī)療保健機構(gòu)或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基及多種器材、物品的滅菌。蒸汽壓力與溫度的關(guān)系如表2-2所示。 
在使用高壓蒸汽滅菌器進行滅菌時,蒸汽滅菌器內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要,因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓;所以當(dāng)水蒸汽中含有空氣時,壓力表所表示的壓力是水蒸氣壓力和部分空氣壓力的總和,不是水蒸氣的實際壓力.它所相當(dāng)?shù)臏囟扰c高壓滅菌周內(nèi)的溫度是不一致的。這是因為在同一壓力下的實際溫度,含空氣的蒸汽低于飽和蒸汽。見表2-3所示。#p#分頁標(biāo)題#e#
 
由上表看出:如不將滅菌鍋中的空氣排除干凈,即達不到滅菌所需的實際溫度。因此,必須將滅菌器內(nèi)的冷空氣完全排除,才能達到完全滅菌的目的。 
    在空氣完全排除的情況下,一般培養(yǎng)基只需在0.1MPa下滅菌30min即可。但對某些物體較大或蒸汽不易穿透的滅菌物品,如固體曲料、土壤和草炭等,則應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時間,或?qū)⒄羝麎毫ι?.15MPa保持1-2h。     (2)滅菌設(shè)備 
    高壓蒸汽滅菌的主要設(shè)備是高壓蒸汽滅菌鍋,有立式、臥式(圖2-5)及手提式(圖2-6)等不同類型。實驗室中以手提式**為常用。臥式滅菌鍋常用于大批量物品的滅菌。不同類型的滅菌鍋,雖大小外形各異。但其主要結(jié)構(gòu)基本相同。

 
高壓蒸汽滅菌器的基本構(gòu)造如下: 
    1)外鍋  或稱“套層”,供貯存蒸汽用,連有用電加熱的蒸汽發(fā)生器,并有水位玻管以標(biāo)志盛水量。外鍋的外側(cè)一般包有石棉或玻璃棉jue緣層以防止散熱。如直接使用由鍋爐接入的高壓蒸汽,則外鍋在使用時充滿蒸汽,作為內(nèi)鍋保溫之內(nèi)鍋  或稱滅菌室,是放置滅菌物的空間.可配制鐵蓖架以分放滅菌物     3)壓力表  內(nèi)外鍋各裝一只,老式的壓力表上標(biāo)明三種單位:公斤壓力單位(kg/cm2),英制壓力單位(1b/in2)和溫度單位(℃),便于滅菌時參照?,F(xiàn)在的壓力表用MPa表示。 
    4)溫度計  可分為兩種,一種是直接插入式的水銀溫度計,裝在密閉的銅管內(nèi),焊插在內(nèi)鍋中.另一種是感應(yīng)式儀表溫度計,其感應(yīng)部分安裝在內(nèi)鍋的排氣管內(nèi),儀表安裝于鍋外頂部.便于觀察。
5)排氣閥  一般外鍋、內(nèi)鍋各一個,用于排除空氣。新型的滅菌器多在排氣閥外裝有汽液分離器(或稱疏水閥).內(nèi)有由膨脹盒控制的活塞。利用空氣、冷凝水與蒸汽之間的溫差控制開關(guān),在滅菌過程中,可不斷地自動排出空氣和冷凝水。 
6)安全閥  或稱保險閥.利用可調(diào)彈簧控制活塞,超過額定壓力即自動放氣減壓。通常調(diào)在額定壓力之下,略高于使用壓力。安全閥只供超壓時安全報警之用,不可在保溫時用作自動減壓裝置。 
    7)熱源  除直接引入鍋爐蒸汽滅菌外,都具有加熱裝置。近年來的產(chǎn)品以電熱為主,即底部裝有調(diào)控電熱管,使用比較方便。有些產(chǎn)品無電熱裝置,則附有打氣煤油爐等。手提式滅菌器也可用煤炭爐作為熱源。 
    (3)幾種常用高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法     1)立式滅菌鍋使用要點: 
    ①加水  由漏斗處加水,加水量應(yīng)在標(biāo)定水位線以上,可在水位玻管刻度處觀察。 
    ⑦裝鍋  將待滅菌物品裝入鍋內(nèi)時,不要太緊太滿,應(yīng)留有間隙,以利蒸汽流通。蓋好鍋蓋后。即可將螺旋柄旋緊。 
    ③加熱和排冷空氣  如果是電熱高壓蒸汽滅菌鍋,則合上電閘通電加熱。如屆非電熱裝置,可點燃煤氣爐或煤油噴燈加溫。同時打開排氣閥及下部排冷氣余水閥,繼續(xù)加熱到鍋中水沸騰,待排氣閥冒出大量蒸汽后,關(guān)閉蓋頂排氣活塞,使冷空氣由下部疏水閥排出。此時如有少量冷凝水排出是正?,F(xiàn)象。待下部疏水閥有大量蒸汽冒出時,證明鍋中已充滿蒸汽,應(yīng)繼續(xù)排汽,使鍋中及滅菌容器中的冷空氣完全排除干凈。一般不應(yīng)少于5min。 
    ④升壓保壓  排氣完畢后.關(guān)小下部疏水閥,鍋內(nèi)壓力即逐漸升高,注意升壓不要過猛。當(dāng)壓力升高到0.lMPa時,調(diào)節(jié)火力,使壓力保持穩(wěn)定。壓力選擇應(yīng)視具體滅菌物品而定,如草炭、土壤等則可在壓力升**0.14MPa-0.15MPa后定時保壓。 
    ⑤降壓與排汽  保壓時間(一般為30min)結(jié)束后,即應(yīng)停止加熱,使其自然冷卻。此時切勿急于打開排氣塞,因為壓力驟然降低,將導(dǎo)致培養(yǎng)基劇烈沸騰而沖掉或污染棉塞。待壓力降**0.025MPa以下可打開排氣閥使余汽排出,同時打開下部疏水閥,排出鍋內(nèi)冷凝水。 
    ⑧出鍋  排氣完畢后,即可扭松螺旋柄使鍋蓋松動。先將鍋蓋打開5-10cm,不必完全推開鍋蓋,  目的是借鍋中余熱將棉塞及包裝紙烘干。烘烤30min后,即可推開鍋蓋,取出已滅菌的物品。     2)臥式滅菌鍋使用要點: 
    ①加水  先將排水閥關(guān)閉,調(diào)整總閥**“全排”。然后,開啟進水閥,放蒸餾水**蒸汽發(fā)生器內(nèi),待水進**距水表頂端大約1-2cm處時,關(guān)閉進水閥,并將總閥調(diào)**“關(guān)閉”。 
    ⑦裝鍋  將待滅菌物品裝入鍋內(nèi),注意不要塞得過緊過滿,盛有培養(yǎng)基的三角瓶和試管應(yīng)立放或適度傾斜.以免滅菌過程中培養(yǎng)基污染棉塞。 
    ②關(guān)門  按順時針方向轉(zhuǎn)動緊鎖手柄**紅箭頭處,使撐擋進入門圈內(nèi)。然后旋動八角轉(zhuǎn)盤,使門和墊圈密合,以滅菌時不漏氣為度,不宜太緊,以免損壞墊圈。 
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    ④通電加溫  待電源控制開關(guān)的旋鈕旋**“開”處,電源指示燈亮,表示已通電,然后再按滅菌物品所需滅菌汽壓將旋切旋**0.07MPa、0.1mPa或0.14MPs處。此時電熱指示燈亮,表示已通電加熱。⑤保溫保壓  當(dāng)蒸汽套層內(nèi)的蒸汽隨加熱達到自動控制壓力時,電熱指示燈會白動熄滅,表示停止加熱。隨著熱力散發(fā)壓力降低,電熱指示燈再亮,表示繼續(xù)加熱,這表明壓力控制器工作正常。當(dāng)套層內(nèi)的蒸汽加熱到所選擇的控制壓力時,即可將套層內(nèi)的蒸汽導(dǎo)入消毒室進行滅菌。此時應(yīng)先將汽液分離器前的冷凝閥開放少許,然后將總閥調(diào)**“消毒”,套層內(nèi)的蒸汽即通過總閥進入消毒室進行消毒,冷凝水則通過汽液分離器自動排出。這時蒸汽套層內(nèi)蒸汽壓力迅速下降,而消毒室內(nèi)的蒸汽壓力逐漸上升,消毒室內(nèi)的溫度表也隨著物品被蒸汽加熱而上升。當(dāng)表卜溫度升到所需消毒溫度(一般為121℃)時,開始計算滅菌時間,維持溫度**滅菌完畢。 
    ⑧出鍋  滅菌完畢后,立即切斷電源,按滅菌物品性質(zhì)和要求,決定消毒室內(nèi)的蒸汽是自然冷卻還是采取“慢排”或“快排”,例如,器械、器皿、固體曲料、土壤、草炭等不致因壓力驟然下降而受影響的物品,可直接將總閥調(diào)**“慢排”和“快排”,使消毒室內(nèi)蒸汽迅速排出。當(dāng)消毒室內(nèi)壓力下降**“0”時,方可緩慢轉(zhuǎn)動鍋門轉(zhuǎn)盤并撥動緊鎖手柄將門開啟5-10 cm。20一30min后將滅菌物品取出,此時滅菌物品即較干燥。溶液及培養(yǎng)基等物品滅菌完畢時,只能將總閥調(diào)**“慢排”,使消毒室內(nèi)蒸汽慢慢排出,以免突然降低壓力導(dǎo)致培養(yǎng)基劇烈沸騰。也可在滅菌完畢后,關(guān)閉總閥,讓滅菌物品自然冷卻。消毒寶壓力表降**“0”時、再將總閥調(diào)**“慢排”數(shù)分鐘取出滅菌物品。 
    ⑦連續(xù)操作  如滅菌物品較多需連續(xù)操作時,應(yīng)先檢查水位。有足夠水量時,可連續(xù)使用。如需加水、應(yīng)把總閥調(diào)**“全排”,打開進水閥加水后繼續(xù)操作。    ⑧保養(yǎng)  每次滅菌完畢后,關(guān)閉電源,停止加熱,隨后將總閥調(diào)**“全排”,排出套層內(nèi)的蒸汽。開啟鉑門少許,散發(fā)剩余蒸汽,使消毒室內(nèi)壁經(jīng)常保持干燥,同時排除蒸汽發(fā)生器內(nèi)的余水。     3)手提式滅菌鍋使用要點: 
    ①加水  使用前在鍋內(nèi)加入適量的水,加水不可過少,以防將滅菌鍋燒干,引起炸裂事故。加水過多有可能引起滅菌物積水。 
    ②裝鍋  將滅菌物品放在滅菌捅中,不要裝得過滿。蓋好鍋蓋,按對稱方法旋緊四周固定螺旋,打開排氣閥。 
    ③加熱排汽  加熱后待鍋內(nèi)沸騰并有大量蒸汽自排氣閥冒出時.維持2-3min以排除冷空氣。如滅菌物品較大或不易透氣,應(yīng)適當(dāng)延長排氣時間,務(wù)必使空氣充分排除,然后將排氣閥關(guān)閉。 
    ④保溫保壓  當(dāng)壓力升**0.1MPa時,溫度達12l℃,此時應(yīng)控制熱源。保持壓力,維持30min后,切斷熱源。 
    ⑤出鍋  當(dāng)壓力表降**“0”處,稍停,使溫度繼續(xù)降**100℃以下后,打開排氣閥,旋開固定螺旋.開蓋,取出滅菌物。注意:切勿在鍋內(nèi)壓力尚在“0”點以上,溫度也在100℃以上時開啟排氣閥,否則會因壓力驟然降低,而造成培養(yǎng)基劇烈沸騰沖出管口或瓶口,污染棉塞,以后培養(yǎng)時引起雜菌污染。     ⑥保養(yǎng)  滅菌完畢取出物品后,將鍋內(nèi)余水倒出,以保持內(nèi)壁及內(nèi)膽干燥,蓋好鍋蓋。